Técnicas de Tinciones

Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada en microscopía para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias que usualmente se utilizan en biología y medicina para resaltar estructuras en tejidos biológicos que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de microscopios. Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definición y examinar grandes cortes de tejido (resaltando por ejemplo fibras musculares o tejido conectivo), poblaciones celulares (por ejemplo clasificando diferentes células sanguíneas) o incluso para resaltar organelas dentro de células individuales.

1.    Tinción de Gram o coloración de Gram:

 Es un tipo de tinción diferencial empleado en bacteriología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram(1853-1938), que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana, como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose bacterias gram positivas a las que se visualizan de color morado, y bacterias gram negativas a las que se visualizan de color rosa, rojo o grosella.

Metodología

·         Recoger muestras.

·         Hacer el extendido con un palillo de madera.

·         Dejar secar a temperatura ambiente o fijarlas utilizando un mechero.

·         Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado tres veces aproximadamente).

·         Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar un minuto.

·         Enjuagar con agua no directamente sobre la muestra

·         Agregar lugol y esperar un minuto aproximadamente.

·         Agregar alcohol acetona y esperar entre 5 y 30 segundos según la concentración del reactivo (parte crítica de la coloración). (las gram - se decoloran, las gram + no)

·         Enjuagar con agua.

·         Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar un minuto. Este tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias gram negativas.

·         Luego lavar levemente con agua

Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión.

2.    Tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR):

Es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, usada para la identificación de microorganismos patógenos, como M. tuberculosis o el género Apicomplexa (coccidios intestinales) entre otros.

Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes: Franz Ziehl, un bacteriólogo, y Friedrich Neelsen, un patólogo.

Metodología:

BAAR: rojo.

Núcleos: azul semi-amarillo.

Variante clásica o "en caliente"=

1.    Hacer un frotis de la muestra.

•          La fijación al calor asegurará de que el frotis quede adherido al portaobjetos. Un frotis muy delgado puede darle resultados falsamente negativos y un frotis muy grueso puede desprenderse del portaobjetos durante la tinción.
•         Utilizando pinzas, coloque los portaobjetos en una gradilla de tinción con los extendidos hacia arriba.

2.    Dejar el frotis sobre el puente de tinción.

3.    Aplicar fucsina-fenicada.

•       Deje que el colorante permanezca sobre los portaobjetos durante 5 minutos. Mantenga el calor durante este período,

4.    Calentar con un mechero hasta la emisión de vapores (3-5 minutos).

•     Se requiere el tiempo adecuado para que la fucsina fenicada penetre y tiña la pared celular de la bacteria. No deje que hierva o se seque el colorante.
•         Lave suavemente el colorante de cada portaobjetos con agua corriente fría hasta que toda la tinción libre quede lavada. Lave suavemente de manera que el extendido no se barra del portaobjetos. Retire el exceso de agua.

5.    Decolorar con alcohol-ácido.

•        Cubra cada portaobjetos con la solución decolorante, tal como alcohol ácido y manténgalo sobre el portaobjetos durante 7 minutos. Si no se decolora suficientemente, el contenido del esputo que no son bacilos TBC puede permanecer teñido. Enjuague con agua una vez más los portaobjetos y quite el exceso de agua. Si los portaobjetos aún están rosa, aplique una cantidad adicional de la solución decolorante de 1 a 3 minutos.

6.    Aplicar azul de metileno (1 minuto).

•          Aplique la solución de contraste, azul de metileno, durante 1 minuto.

7.    Enjuagar con agua

•          Vuelva a enjuagar con un leve chorro de agua e incline cada portaobjetos hasta drenar el exceso de agua. Finalmente, coloque cada portaobjetos en una gradilla a que sequen al aire.

8.    Ahora coloquele una pequeñita gota de aceite de inmersión y haga la observación al microscopio con 100 x 100

3.    Tinción de esporas

MÉTODO 

•     Realizar un extendido de las bacterias suplida y fijarlo a la llama
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•     Cubrir con verde malaquita y calentar durante 10 minutos aplicando la llama de un mechero o hisopo impregnado en alcohol por debajo de la lámina. Debe haber emisión de vapor sin que la preparación llegue a hervir o secarse. Anadir más colorante cuando se esté secando
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•       Dejar enfriar la lámina por 1 o 2  minutos. Lavar con el agua del tubo por 30 segundos
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•      Cubrir la preparación con Safranina por 30 segundos
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•       Lavar, escurrir, limpiar el reverso de la lámina, deja secar y observar al microscopio (1000x) Anotar observaciones, comparar con una tinción de Gram     
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4.    Tinción in vivo e in vitro: 

Una tinción in vivo (tinción supravital) es el proceso de teñir tejidos vivos. Al provocar que determinadas células o estructuras adquieran los colores de contraste, se puede estudiar su ubicación y morfología mientras están desempeñando su función. El propósito más común es revelar detalles de la cito estructura que de otra manera no resultarían evidentes, sin embargo, la tinción supravital puede revelar además donde aparece un determinado producto químico o donde se lleva a cabo una determinada reacción química dentro de las células o tejidos.

·         Fijación: de por sí, esta etapa puede consistir en varios pasos. La fijación es una modificación de las propiedades fisicoquímicas de las proteínas que forman una célula o tejido y que tiene por finalidad preservar las formas de las células o tejidos tanto como sea posible. A veces se puede utilizar una fijación por calor para matar, adherir y alterar un espécimen de modo que acepte la tinción. La mayor parte de las veces se utiliza un fijador químico. Los fijadores químicos en general causan la formación de enlaces cruzados entre proteínas, o entre proteínas y otras sustancias presentes en la muestra, incrementando su resistencia mecánica. Entre los fijadores químicos más comunes se encuentran el formaldehído, etanol, metanol, y/o el ácido pícrico. Pequeños bloques de tejido pueden ser embebidos en parafina o algún polímero, proceso conocido como inclusión, para incrementar su resistencia y estabilidad, y para hacer más fácil cortarlos en rodajas extremadamente delgadas, ya que cuanto más delgado es un corte histológico, más definición se obtiene en las imágenes microscópicas.

·         Permeabilización este paso implica el tratamiento de las células con un surfactante suave. Este tipo de tratamiento tiene como finalidad disolver la membrana celular para permitir que las grandes moléculas de colorante puedan acceder a las estructuras del interior de las células.

·         Montaje frecuentemente implica adherir los cortes histológicos a un portaobjetos de vidrio para su observación al microscopio o análisis. En algunos casos, se puede cultivar a las células directamente sobre le portaobjetos. En muestras de células sueltas, como las que se presentan en un extendido de sangre o de fluidos biológicos, la muestra puede ser aplicada directamente sobre el portaobjetos. Para piezas de tejido de mayor tamaño, se utiliza un micrótomoque corta la muestra en rodajas sumamente delgadas. Estas rodajas son luego adheridas al portaobjetos por medio de una substancia que funciona como pegamento, ya sea una resina transparente, gelatina o clara de huevo. El montaje tiene por finalidad aumentar la resistencia mecánica de una muestra que de otra manera sería extremadamente frágil, para que soporte el proceso de teñido conservando lo más posible su estructura original.

5.    Tinción de Wright:

Es un tipo de tinción usada en histología para facilitar la diferenciación de los tipos de células de la sangre. Se usa principalmente para teñir frotis de sangre y punciones medulares, para ser examinadas al microscopio. Encitogenética se usa para teñir cromosomas, para facilitar el diagnóstico de síndromes y enfermedades.

Metodología:

Fijación de la muestra

 La fijación de la muestra se realiza agregando unas gotas de alcohol metílico y dejando secar

Tinción de la muestra

Tinción con el reactivo de Wright

Tomar 200 µL de Wright-Giemsa Stain, Modified

Distribuir homogéneamente

Después de 1 minuto agregar 500µL de Agua destilada y homogenizar

Incubar por 3 minutos a temperatura ambiente

 Lavar con agua corriente durante 1 minuto

Observar al microscopio

6.    Tinción de Giemsa:

Es un método habitual para el examen de frotis sanguíneos, cortes histológicos y otro tipo de muestras biológicas. Este método tiene utilidad sobre todo para poner de manifiesto las rickettsias localizadas dentro de las células huéspedes. 

Metodología:

·         Desparafinar e hidratar.

·         Aplicar solución de trabajo de Giemsa durante 10 minutos.

·         Deshidratar con alcohol absoluto, 3 cambios.

7.    Tinción de May Grünwald-Giemsa:

 Es una técnica de tinción derivada del método de Romanowsky que se utiliza principalmente para el coloreo de muestras de frotis sanguíneos o extendidos de médula ósea. Como el resto de las coloraciones basadas en la técnica de Romanowsky, la técnica MGG permite diferenciar cualitativa y cuantitativamente los principales elementos formes de la sangre.

 8.    Tinción tricrómica de Masson: 

Es una técnica de coloración especial que permite visualizar claramente las fibras de colágeno tipo I que forman fibras gruesas o haces, diseñados para dar resistencia; también evidencia, aunque en menor intensidad, las fibras reticulares. Se emplean tres colorantes para diferenciar el núcleo celular, el citoplasma y las fibras de colágeno.

Metodología:

·         Desparafinar e hidratar hasta el agua destilada de manera habitual.

·         En material fijado en soluciones de formaldehído o alcohólicas se recomienda hacer un mordentaje previo con líquido de Bouin durante 1 hora a 56-60 ºC o toda la noche a temperatura ambiente.

·         Enfriar y lavar en agua destilada hasta que desaparezca el color amarillo.

·         Teñir con hematoxilina férrica durante 10 minutos. Lavar en agua corriente durante 10 minutos.

·         Lavar en agua destilada.

·         Teñir con la solución de escarlata-fucsina ácida durante 2-5 minutos.

·         Lavar en agua destilada.

·         Tratar con la solución de ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico durante 10-15 minutos si se va a colorear con la solución de azul de anilina, o en la solución acuosa de ácido fosfotúngstico al 5% durante 15 minutos si se desea teñir con verde luz.

·         Teñir con solución de azul de anilina 15 minutos o con solución de verde luz 5 minutos.

·         Lavar en agua destilada.

·         Diferenciar en la solución de ácido acético al 1% durante 3-5 minutos.

·         Deshidratar, aclarar y montar.

Tinción de Van Gieson: 

Corresponde a la mezcla de ácido pícrico-fucsina ácida y hematoxilina férrica de Weigert.

Es el método más simple mediante tinción para diferenciar colágeno de otros tejidos conectivos. Esta técnica fue desarrollada por el neuropsiquiatra y patólogo Ira Van Gieson.

Metodología:

·         Los preparados histológicos son sumergidos en agua por unos 5 minutos.

·         Se sumergen 5 minutos en hematoxilina férrica de Weigert.

·         Se lavan en agua corriente (hasta que no suelte más colorante).

·         Se lavan en agua destilada.

·         Se sumerge en ácido pícrico-fucsina ácida por 5 minutos.

·         se sumerge en alcohol al 95° por 10 minutos

·         Se sumerge en alcohol al 100° por 5 minutos

·         Se sumerge dos veces diferentes frascos de xilol 5 minutos en cada ocasión

 9.    Tinción negativa:  

Es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir pero se colorea un cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de partículas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.