Técnicas de
microscopia
Una de las finalidades de la microscopía es
permitir observar los especímenes de la mejor manera posible, logrando un buen
balance entre el contraste y la resolución. Esto es de extrema utilidad en
muestras incoloras, tales como las células vivas, que en su estado natural son
transparentes y con poco contraste, en las cuales los detalles permanecen
invisibles a pesar de la resolución
Microscopía
Confocal
La
microscopía confocal parte de los principios de la microscopía de fluorescencia
y los mejora con un diseño capaz de eliminar la fluorescencia fuera de foco, es
decir, procedente de planos superiores e inferiores al plano focal. El
microscopio confocal por tanto captura exclusivamente la fluorescencia que se
genera en el plano focal, y consigue mejor contraste y resolución. Los
elementos necesarios para conseguirlo son varios.
Microscopia
Optica
Permite la observación de un objeto a ciertos
aumentos, dependiendo de los objetivos que se utilicen en cada caso. Asimismo,
un microscopio puede adoptar varias configuraciones que permiten la observación
de diferentes tipos de muestra: por transmisión, por reflexión, iluminado en
claro o en campo oscuro, etc. Y con complementos específicos observar
irregularidades o cambios laterales que no serían percibidos si no bajo ciertas
condiciones de observación: contraste de fases, contraste interferencial,
microscopía
se trabaja sobre el microscopio.
Fijación: tratamiento químico para matar a las
células de modo que quedan como eran in vivo, y que las moléculas queden
fijadas, que no se eliminen/ laven en manipulaciones posteriores.
Seccionado: se corta el tejido muy fino, de forma
que lo atraviese la luz. Para ello se emplean los micrótomos, estos pueden ser:
De mano: la muestra debe incluirse en un medio,
la médula de saúco (de sauce, Salix).
De parafina: incluir la muestra en parafina, una
especie de cera. Antes la muestra tiene que pasar un proceso: deshidratación,
se impregna con disolvente Xilol/Xileno) de parafina, este junto a la parafina,
y parafina únicamente.
De congelación: la muestra se impregna de
nitrógeno líquido , y luego se corta con cuchilla de acero. Es el procedimiento
más rápido.
Tinción: si el tejido es casi transparente hay
que añadirle colorantes para permitir la visión. Normalmente se emplean más de
un colorante de diferente color y también químicamente distintos. Esta es una
sustancia química que reacciona con unas moléculas determinadas del tejido,
quedándose fijado, así se obtiene el contraste.
Montaje de la preparación: se montan los
diferentes cortes en el portaobjetos. Habitualmente se emplea el cubreobjetos,
entre porta y cubre no debe haber aire. Dependiendo de la duración, la
preparación puede ser:
Temporales: se emplea agua y otras substancias.
Permanentes: indefinidas, se emplean bálsamo de
Canadá y resinas.
El orden entre montaje de la preparación y
tinción, puede variar. con luz ultravioleta, de fluorescencia, etc.
Microscopia
de fluorescencia
es una variación del microscopio de luz ultravioleta
en el que los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de
onda.
Microscopía
electrónica
El principio de la microscopía electrónica es muy
similar al de la microscopia de luz y se han desarrollado dos principales
técnicas
1. Microscopía electrónica de transmisión: Se
observa a través del espécimen (trans- iluminación). El espécimen se corta en
láminas ultra finas (en el orden de nanómetros) que se colocan en una rejilla
de cobre, la cual es bombardeada con un haz de electrones enfocado. Una silueta
del espécimen se proyecta en una pantalla fluorescente o placa fotográfica
situada por debajo del mismo. La resolución puede ser de 0,2nm.
2 Microscopía electrónica de barrido: Se observa
la superficie de un espécimen sólido (epi-iluminación). Se puede lograr una
resolución de 10nm y un aumento hasta de 20.000x. Se producen imágenes muy
interesantes en 3D (tridimensionales) gracias a una mayor profundidad de campo.
Se escanea la superficie del espécimen con un haz de electrones (primarios) y
los electrones que rebotan (secundarios) son recogidos por un detector. La
señal se observa en un monitor de televisión. Los átomos del espécimen producen
rayos X que también son detectados.
Microscopia
de contraste o fases
La
microscopia de contraste de fases y la del microscopio de interferencia nos dan
la posibilidad de observar células vivas y sin ninguna preparación, ya que al
realizar otros procedimientos existe la posibilidad de que algunos de sus
componentes puedan perderse o distorsionarse por métodos como la fijación,
coloración, congelación, y otros, así, estos instrumentos ópticos ayudan a
resolver el problema.
Microscopia
de interferencia diferencial
La microscopía de contraste de interferencia
diferencial se basa en el uso de una luz polarizada que pasa primero a través
de un prisma y forma 2 haces de luz que atraviesan la muestra y van a la lente
del objetivo. Ahí los 2 rayos diferentes se combinan y debido a las diferencias
de índice de refracción de las partes de la muestra que han atravesado, se
genera una diferencia de fase con interferencia. Gracias a ello se pueden ver
el núcleo de células eucariotas, esporas, vacuolas entre otras estructuras microscópica
as.
Microscopia
de campo obscuro
El objeto es iluminar dispersa la luz y se hace
así visible contra el fondo oscuro que tiene detrás, como las partículas de
polvo iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una habitación cerrada. Por
ello las porciones transparentes del espécimen quedan oscuras, mientras que las
superficies y partículas se ven brillantes, por la luz que reciben y dispersan
en todas las direcciones, incluida la del eje óptico que conecta el espécimen
con la pupila del observador. Esta forma de iluminación se utiliza para
analizar elementos biológicos transparentes y sin pigmentar, invisibles con
iluminación normal, sin fijar la muestra, es decir, sin matarla. También es
bastante utilizado en la observación de muestras metalográficas para la
observación de detalles en superficies con alta reflectancia.
Microscopia
de campo claro
El campo claro es la forma más simple de
microscopía donde la luz pasa a través de o reflejada del espécimen. La
iluminación no se altera por aditamentos que cambien las propiedades de la luz (como polarizadores o filtros).
Se utiliza una fuente de luz brillante para su
examen. Bright field microscopy is the simplest of all the optical microscopy
illuminationtechniques.La iluminación se transmite desde abajo y se observa
desde arriba. En campo claro toda
la luz desde el espécimen y sus alrededores es colectada por el objetivo para
formar una imagen contra un fondo brillante, el contraste en la muestra es
causada por la absorbencia de algo de la luz transmitida en las zonas densas de
la muestra.
Bright field microscopy is the simplest of a range oftechniques used for
illumination of samples in light microscopes and its simplicity makes it a
popular technique.
Es utilizado para formar una imagen a partir de
un corte histológico; usa luz visible,por esto la muestra debe ser lo bastante
fina como para que los haces de luz puedan atravesarla.
Microscopio
es un instrumento que permite observar
objetos que son demasiado pequeños para ser vistos a simple vista. El tipo más
común y el primero que se inventó es el microscopio óptico. Se trata de un
instrumento óptico que contiene dos o más lentes que permiten obtener una
imagen aumentada del objeto y que funciona por refracción. La ciencia que
investiga los objetos pequeños utilizando este instrumento se llama
microscopía.
Tipos de
microscopios
•
Microscopio
electrónico de barrido.
•
Microscopio
óptico
•
Microscopio
simple
•
Microscopio
de luz ultravioleta
•
Microscopio
de fluorescencia
•
Microscopio
petrográfico
•
Microscopio
de campo oscuro
•
Microscopio
de contraste de fases
•
Microscopio
de luz polarizada
•
Microscopio
confocal
•
Microscopio
electrónico
•
Microscopio
electrónico de transmisión
•
Microscopio
electrónico de barrido
•
Microscopio
de iones en campo
•
Microscopio
de sonda de barrido
•
Microscopio
de efecto túnel
•
Microscopio
de fuerza atómica
•
Microscopio
virtual
•
Estereomicroscopio
binocular
•
Microscopio
de fuerza nuclear
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